ELISA試劑盒此刻酶催化無色的底物生成有色的產品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在必定時刻內，陰性孔可堅持無色，而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強。恰當進步溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，參加底物后的反響溫度和時刻應按規則力求。ELISA試劑盒時刻通常不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色狀況恰當縮短或延伸反響時刻，及時判別。
OPD底物顯色通常在室外溫或37 ℃反響20-30分鐘后即不再加深，再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響應避光進行，顯色反響結束時參加停止液停止反響。OPD產品用硫酸停止后，顯色由橙轉向棕。
TMB受光照的影響不大，ELISA試劑盒可在室溫中置于操作臺上，邊反響調查成果。但為確保實驗成果的穩定性，宜在規則的恰當時刻閱覽成果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐步削弱，至2小時后即可*衰退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍色保持較長時刻（12-24小時）不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，各類酸性停止液則會使藍色轉變成，此刻可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。
ELISA試劑盒比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的實驗，需先將板置于規范96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊際剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。