內源性生物素：生物素是一種維生素，作為一種輔酶參與羧化反應。在人體組織中，絕大多數生物素與線粒體丙酮酸鹽羧化酶相關，因此，富含線粒體的細胞具有豐富的內源性生物素，如腎臟、肝臟以及一些腫瘤細胞。如果應用生物素/卵白素檢測系統，由于卵白素可以和生物素不可逆地強結合，勢必會造成非特異性染色，熱介導的抗原修復可以顯著“復活”內源性生物素，所以更加加劇這種非特異背景染色。解決的方法除了換成非生物素的檢測系統外，還可以用以下簡單的方法封閉內源性生物素。首先用蛋清中的卵白素（一個雞蛋清加入到100ml的PBS中）封閉內源性生物素，再用5%奶粉作為生物素替代品（5克奶粉加入100ml的PBS/TBS中）來封閉卵白素中未結合的位點，沖洗后即可加一抗。內源性過氧化物酶天酒地   一般紅細胞和嗜中性粒細胞中過氧化物酶含量比較高，會造成非特異性染色。滅活內源性過氧化物酶的方法：0.3%-3%H2O2，用PBS（pH7.4）或蒸餾水或甲醇配制。沖洗步驟免疫組化染色步驟中包括多次沖洗過程，任何一步出現沖洗不干凈的問題，都有可能產生背景染色。解決的方法可以在沖洗液中加入吐溫20，一般在1000ml的沖洗液中加入0.2ml的吐溫20即可。鼠單抗用于鼠組織由于小鼠組織中可能含有內源性IgG，所以檢測系統就會識別這些抗體，造成非特異性染色。解決的方法要么封閉內源性IgG，要么直接使用商品化的Mouse-to-Mouse檢測試劑盒。固定不及時　　可以造成蛋白彌散，會產生異位染色。干片孵育的過程中沒有放入濕盒或加入液體過少或孵育時間過長，都會造成局部（尤其是邊緣）干片，應該避免。修復過度抗原熱修復（尤其是使用EDTA）有時會造成細胞核異位染色，對于細胞核染色的抗體這種情況應通過對照片加以甄別