在ELISA檢測試劑盒中一般有3次，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA檢測試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。

    也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。洗滌在ELISA檢測試劑盒過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELISA檢測試劑盒就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA檢測試劑盒操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA檢測試劑盒儀器配有特殊的自動洗滌儀外，

過程如下：
(1)浸泡式 a.吸干或甩干孔內反應液;b.用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后，即甩去);c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，ELISA檢測試劑盒浸泡時間不可隨意縮短;d.吸干孔內液體。吸干應*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;e.重復操作c和d，洗滌3-4次(或按說明規定)。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，

其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
(2)流水沖洗式 流水沖洗法zui初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，ELISA檢測試劑盒持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為*，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。